Ontogenia - guianense

Este trabalho foi desenvolvido no então Laboratório de Filarioses e Vetores, da Coordenação de Ciências da Saúde, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e é reflexo da dissertação de Mestrado (apresentada em 2001) por Maria Claudete Vasconcelos dos Passos, no Curso de Pós Graduação em Entomologia (Universidade Federal do Amazonas / Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia). A referida autora da dissertação foi minha orientanda (V.Py-Daniel). Foram feitos ajustes no texto, no sentido de apropriá-lo para publicação, tendo em vista que já fazem 14 anos que o texto original foi desenvolvido, assim, alguns aspectos referentes com revisões históricas foram mantidos e outros não. Foram acrescidas algumas bibliografias, tanto no sentido comparativo com a ontogenia de outras espécies, de diferentes gêneros, como com a de guianense, publicada, em 2015, por Santos-Neto & Hamada & Couceiro. 

ONTOGENIA LARVAL DE Thyrsopelma guianense (Wise, 1911) (DIPTERA:SIMULIIDAE), NO RIO JAUAPERI, RORAIMA, BRASIL

Passos, M.C.V. dos (1); Py-Daniel,V. (2*); Medeiros,J.F (3); Pessoa,F.A.C. (4).; Barbosa,U.C.(2); Silva,O.S.(2); Junior,E.S.L.(2**)

1 – Universidade Federal de Roraima; 2 – INPA/LETEP (* - atualmente associado a UnB/ICB/DZ//LEF ** - atualmente no INPE/CRH/DGP); atualmente FIOCRUZ-RO; 4 - atualmente FIOCRUZ-AM

Palavras Chaves: Ontogenia Larval, Simuliidae, Thyrsopelma guianense, Jauaperi, Roraima.

RESUMO

No Brasil, vários autores tem contribuído para aumentar o conhecimento sobre os números de estádios larvais nas espécies Simuliidae. O objetivo deste trabalho foi determinar o número de estádios para Thyrsopelma guianense (Wise,1911), descrevendo e ilustrando as possíveis mudanças morfológicas nos diferentes estádios. As larvas de Thyrsopelma guianense utilizadas foram coletadas aderidas a macrófitas aquáticas da espécie Mourera fluviatilis (Podostemaceae), no rio Jauaperi, na localidade Cachoeira Travessão, município de Rorainópolis, Roraima, Brasil. Essas larvas, ainda no campo, foram preservadas em álcool 70%. Para determinação do número de estádios larvais de T. guianense, foram tomadas duas medidas: o comprimento lateral da cápsula cefálica e a largura do apódema cefálico. Estes dados foram analisados empregando-se: histograma de freqüência, regressão linear, teste t-Student; Log₁₀, Regra de Dyar, regra de crescimento de Crosby. Através das análises estatísticas foram determinados sete estádios larvais, os quais foram caracterizados, incluindo ilustrações.

INTRODUÇÃO

Os simulídeos, conhecidos popularmente no Brasil como “pium” e “borrachudo” são dípteros nematóceros pertencentes a família Simuliidae, com um número de espécies acima de 2100 (Adler,P.H. & Crosskey,R.W- 2015)

No Brasil são assinaladas mais de 100 espécies contidas em 15 gêneros: Araucnephia, Cerqueirellum, Chirostilbia, Coscaroniellum, Ectemnaspis, Hemicnetha, Inaequalium, Kempfsimulium, Lutzsimulium, Notolepria, Psaroniocompsa, Psilopelmia, Shelleyellum, Trichodagmia, Thyrsopelma.

O gênero Thyrsopelma (Enderlein, 1934) apresenta atualmente (2015) 10 espécies: duodenicornia (Pepinelli, Hamada & Trivino-Strixino, 2005), guianense (Wise, 1911), itaunense (D´Andretta & Gonzalez, 1964), jeteri (Py-Daniel, Darwich, Mardini, Strieder & Coscarón, 2005), orbitale (Lutz, 1910), perplexa (Shelley, Maia-Herzog, Dias & Couch, 1983) scutistriata (Lutz, 1909), nunesdemelloi (Hamada, Pepinelli & Hernández, 2006), litobranchia (Hamada, Pepinelli, Matos-Gloria & Luz,2010). 

Simulium guianense foi descrita por Wise, em 1911, com material coletado no Essequibo, na Guiana. D´Andretta & D´Andretta (1945) trabalhando com material de Piracicaba, Estado de São Paulo, identificado como Simulium orbitale assinalaram diferenças nos histoblastos branquiais das pupas e descreveram uma nova espécie, Simulium pintoi. Ramírez-Pérez (1971) descreveu uma nova espécie, Simulium ortizi, sendo que em 1982, Ramirez et al., colocaram a mesma como sinônimo de Simulium pintoi. Coscarón (1987) sugere que Simulium albopictum Lane & Porto, seja sinonimizado com Simulium pintoi. Shelley et al. (1997), examinando o material tipo de Simulium pintoi, e comparando com o material tipo de Simulium guianense, conclui que a primeira é sinônimo de guianense.

Os simulideos são causadores da transmissão de patógenos para humanos e outros animais em várias partes do mundo, como também de manifestações alérgicas que são conhecidas como síndromes hemorrágicas. Também apresentam impacto no mercado econômico em muitas regiões do mundo (Crosskey, 1990; Merrit & Cummins, 1996). Na região sul do Brasil (Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná) representam problemas no turismo e na exploração pecuária, além de apresentarem real importância negativa na produtividade agrícola. Os simulideos determinam prejuízo, portanto de repercussão negativa, ao nível médico-sócio-econômico (Souza, 1984).

A família Simuliidae, apresenta como uma de suas maiores importâncias, ao nível de saúde publica, o fato de apresentar espécies que servem de vetores da filaria Onchocerca volvulus (Leuckart, 1893), causadora da enfermidade conhecida como oncocercose (Cegueira dos rios, Doença de Robles, Volvulose, Eripsela da Costa, Mal Morado). Outra filaria que também é transmitida pelos simulideos é a Mansonella ozzardi (Manson, 1897) causadora de uma das mansoneloses conhecidas. Muitos outros animais (gado, patos, veado – e outros cervídeos ) também fazem parte do ciclo transmissivo de outras filarias por simulideos. Além de serem transmissores de nematóides, também são conhecidos por transmitir vários protozoários para aves, bem como vírus. Levantamentos epidemiológicos desenvolvidos nos anos de 1994-1997, na área brasileira do foco oncocercótico trans-fronteiriço (Brasil/Venezuela) assinalaram que a principal espécie vetora da oncocercose era Thyrsopelma guianense.

ONCOCERCOSE

A oncocercose é causada pelo helminto da superfamília Filarioidea, família Onchocercidae). A Onchocerca volvulus apresenta um ciclo biológico heteroxênico, sendo propagado entre as pessoas através da picada das fêmeas de algumas espécies de simulideos. No Brasil os simulideos são conhecidos como “piuns” (região norte) e “borrachudos” (River Blindness Foundation, 1993).

No Brasil, o primeiro caso assinalado foi descrito por Bearzoti et al. (1967) em uma criança com apenas três anos de idade que apresentava dois nódulos (oncocercomas) no couro cabeludo e que teria adquirido a doença no estado de Roraima. Py-Daniel (1989) obteve informações que um missionário proveniente do continente africano, portador da Onchocerca volvulus, viveu no alto Solimões (Estado do Amazonas) por muito tempo, sendo que o mesmo apresentava alterações oculares provenientes da oncocercose. O missionário morreu muitos anos depois ainda com oncocercose. Esta informação indica a presença da oncocercose no Brasil antes da ocorrência registrada por Bearzoti e colaboradores (Py-Daniel, 1989; Neves, 1995).

BIOECOLOGIA

A familia Simuliidae é quase cosmopolita, não ocorrendo apenas em alguns lugares com ausência de águas correntes, como regiões polares e desertos, apesar de ser encontrada em ilhas e oásis nos desertos, onde a água corrente é limitada (Shelley, 1994). Ocorre desde o nível do mar até atitudes acima de 4.000 metros onde a neve e o gelo fundido formam fluxos de água corrente, e onde exista temperatura suficiente para tornar os ovos viáveis e a provisão de alimento das larvas seja possível, permitindo assim o desenvolvimento completo (Merrit & Cummins, 1996).

Em relação às espécies vetoras, existem diferenças biológicas em função das áreas climáticas, p.ex., entre florestas e savanas, que influem na densidade populacional, longevidade, raio de ação e poder de dispersão. Ocorrendo também variações estacionais, o que pode estar diretamente correlacionado com o ritmo de atividade e potencial transmissivo. Nem todas as fêmeas de simulideos são hematófagas em humanos, algumas espécies são restritas para pássaros e outros animais, sendo algumas polífagas. O adulto macho dos simulideos se alimenta do néctar como fonte de energia. A hematofagia é exercida pela fêmea principalmente após a cópula, porque requer sangue para a ovulação. Depois do acasalamento, as fêmeas colocam ovos em uma diversidade de ambientes, desde que seja lótico (de pequenos córregos a grandes rios) sendo que a escolha do ambiente varia com a espécie. Cada fêmea apresenta em média entre 200 e 500 ovos em um único ciclo gonadotrófico, depositando os ovos na superfície da água que posteriormente ficam aderidos em algum substrato. Dependendo da espécie e fatores ambientais como temperatura da água, o período de incubação varia de 2 a 30 dias, podendo se prolongar caso a espécie apresente diapausa. A eclosão da larva ocorre cerca de quatro dias nos meses de verão, sendo que no inverno pode ocorrer um retardamento da eclosão. A larva apresenta uma ventosa na extremidade posterior, com a qual se fixa no substrato escolhido. Geralmente podem ser observadas dezenas de larvas “atapetando” uma pedra, parecendo lodo espesso. A larva pode permanecer no local onde ocorreu a eclosão se o substrato e a provisão de alimento forem adequados e suficientes para ela, caso contrário, podendo sair vagueando a jusante em “fios de seda” à procura de locais que satisfaçam suas necessidades. As larvas de alguns tipos de simulídeos geralmente encontram-se associadas à macrófitas aquáticas da família Podostemaceae, como por exemplo, Mourera fluviatilis, que formam associações sobre rochas e crescem ao longo das corredeiras / cachoeiras, firmemente aderidas por meio de estruturas e secreções de substâncias que auxiliam na fixação ao substrato. A espécie Mourera fluviatilis, na Amazônia, durante a estação chuvosa desenvolve as partes vegetativas e com a diminuição dos níveis de água emitem flores que produzem grandes quantidades de sementes. Na fase reprodutiva apresenta suas partes florais acima do nível das águas e sua folhagem submersa, essa variação temporária ou sazonal tem efeito importante sobre a ecologia e a biologia dessas plantas. Em ambientes com declives suaves e bom arejamento, essas plantas podem se apresentar substancialmente maiores, com área foliar mais larga e consistente, bem como flores e frutos maiores, como por exemplo, Rhyncholacis linearis que registra 40 cm de comprimento, porém em condições ótimas chegam até 140 cm de comprimento (Tavares, 1997).

As larvas dos simulídeos apresentam uma série de mudas (4-9 mudas, mas geralmente sete). As taxas de crescimento flutuam dependendo da temperatura da água e quantidade e disponibilidade de alimento, após as mudas, secretam um casulo que é fixado firmemente e transformam-se em pupas, sendo que a duração da fase pupal também varia de acordo com a temperatura da água, mas, geralmente é de 2 a 7 dias, podendo em certas circunstâncias duas ou três semanas. Quando o adulto estiver pronto para emergir, sai da pupa, deixando um “T”. Nasce debaixo da água, envolvido em uma bolha de ar que sobe até a superfície e estoura liberando o simulideo, que voa e procura um ponto para aguardar o endurecimento da cutícula. Depois de acasalar, procura uma fonte satisfatória de sangue, e todo o ciclo de vida começa novamente. O número de gerações anuais varia de acordo com a espécie e é influenciado por fatores geográficos e climáticos. Em áreas tropicais, podem ocorrer de 16 a mais gerações, nas regiões temperadas podem haver seis gerações; em ambientes como o Ártico, normalmente uma única ou mesmo duas gerações (Rey, 1992; Neves, 1995; Merrit & Cummins, 1996).

No estágio larval o número de estádios pode variar dentro de uma espécie, assim como altas temperaturas da água podem diminuir o tempo de desenvolvimento. O número de estádios e tamanho da larva, na maturidade,  são extremamente variáveis (Ross & Merrit, 1978). Vários autores estudaram o número de estádios larvais de simulideos e encontraram uma variação de 4 a 9 estádios. Ross & Merrit (1978) listaram os autores e os números de estádios que eles encontraram em Simuliidae e somente Smith (1969 apud Ross & Merrit, 1978) encontrou 8 estádios larvais. Os demais acharam espécies com 4, 6, 7 e 9 estádios larvais, sendo que 7 estádios foi o número mais comumente encontrado (Gorayeb, 1981).

Existem alguns estudos efetuados procurando correlacionar os estádios a biometria das larvas, diferenças morfológicas, biologia e ecologia, dos quais citamos os de sete estádios larvais de Prosimulium mixtum Syme & Davies e Prosimulium fuscum Syme & Davies, onde foram analisadas larvas de um trecho do rio Michigan, durante o outono de 1976, no qual utilizaram o teste T-Student para verificar a precisão do número de estádios larvais, confirmados pela aplicação da Regra de Crescimento de Crosby (Craig, 1975); Simulium venustum também foi estudado para determinação do numero de seus estádios larvais, onde o mesmo apresentou seis estádios larvais (Mokry, 1976); as espécies Prosimulium fuscum Syme & Davies, Prosimulium mixtum Syme & Davies apresentaram sete estádios; Simulium vittatum Zettersted e Stegopterna mutata (Malloch) com seis e sete estádios respectivamente, e Cnephia dacotencis, que não foi possível distinguir, com certeza, o número de estádios larvais (Ross & Merrit, 1978).

A principal espécie vetora de Onchocerca volvulus (Leuckart, 1893) na Amazônia é Thyrsopelma guianense, presente durante o ano todo e sendo mais numerosa na variação sazonal de vazante para seca; é predominante em regiões montanhosas de muitos rios dos Escudos do Brasil Central e das Guianas, onde a preferência tópica para as fêmeas picar é da cintura para baixo, mais especificamente na região perna/pé e secundariamente nas coxas (Py-Daniel, 1997; Py-Daniel et al., 1999).

OBJETIVOS

GERAL – Obter dados referentes á morfologia larval para proporcionar futuros estudos filogenéticos e biogeográficos em Thyrsopelma.

ESPECÍFICO – Assinalar o número de estádios larvais de Thyrsopelma guianense (Wise, 1911). Analisar as possíveis variações morfológicas dentro dos estádios larvais encontrados, e procurar detectar se existem novos caracteres que possam auxiliar na taxonomia do gênero.

MATERIAL E MÉTODO

Área de Estudo

O material utilizado para este estudo foi coletado no rio Jauaperi, localidade denominada de Cachoeira Travessão (0^o28´48” N / 060^o29´49” O), estado de Roraima (Figura 1). Nesta localidade a espécie de maior grau de antropofilia, foi T. guianense, com maior incidência de adultos na época da variação sazonal de vazante para seca, e confirmando que as preferências tópicas para o hematofagismo no ser humano são da cintura para baixo (Py-Daniel, 1997; Py-Daniel et al., 1999). O acesso ao local de trabalho foi feito por propriedade particular, adentrando uma porteira, onde no local exista uma pastagem, seguindo por mata primária até as margens do rio Jauaperi, na cachoeira Travessão. A distância da porteira ao local de coleta foi de 5 km.

Figura 1 – Trecho de mapa do Estado de Roraima, mostrando o local de coleta. Mapa elaborado pela Secretaria de Planejamento, indústria e Comercio - SEPLAN, do Governo de Roraima.

Coletas das larvas

As larvas foram coletadas no mês de novembro de 1999, sendo o período de seca no rio Jauaperi. O material recolhido na cachoeira constou de macrófitas aquáticas (Podostemaceae) submersas, sendo necessária a utilização de tesoura, além da força física para a extração das plantas do substrato rochoso no qual ficam aderidas. Estas plantas estavam no seu período de floração, onde foram observados os estróbilos floridos expostos acima do nível das águas, muitos deles secos sob as rochas, repletos de sementes. O material utilizado neste estudo foi obtido das porções submersas (ainda verdes), nas quais as larvas dos simulideos ficam aderidas (Figura 3). As plantas foram coletadas e acondicionadas em sacos plásticos de 18 litros. Foram coletadas duas espécies de podostemaceas neste ambiente. Aos sacos plásticos contendo as plantas foi acrescentado álcool 70%, sendo os mesmos transportados para o Laboratório de Filarioses e Vetores (LFV) do INPA (Figura 2).

Figura 2 – Coleta manual e acondicionamento das podostemaceas em sacos plásticos.

Figura 3 – Macrófita (Podostemaceae) submersa, com estróbilos expostos.

Análises em laboratório

Triagem Inicial

As macrófitas foram retiradas dos sacos plásticos e colocadas em bandejas plásticas de fundo branco, sendo o trabalho inicial especificamente para extrair todo o material entomológico (fauna associada, ovos-larvas-pupas-exúvias de simulídeos) das folhas (limbo, pecíolo, bainha). O material retirado das macrófitas foi acondicionado em frascos de vidro com capacidade de 500 ml e imersos em álcool 70%.

Triagem da Fauna Associada e simulídeos

Este material passou por uma triagem seletiva, separando a entomofauna associada (ao nível de ordem) e os simulídeos tanto ao nível específico e como os estágios de T. guianense.

Triagem das larvas de T.guianense por tamanho

Utilizou-se o papel milimetrado, tendo como base o número de quadrados, onde foram obtidos inicialmente 12 tamanhos diferentes de larvas. Nesta fase foi triado um número abundante de larvas para serem utilizadas no trabalho.

Biometria Larval

Após a obtenção de 12 amostras de larvas de diferentes tamanhos, foram tomadas as medidas do corpo, pós-genae (comprimento lateral da cápsula cefálica) e o apodema cefálico. Sendo medidas 50 larvas de cada vidro (com 600 larvas medidas no total). Para esta fase utilizou-se uma placa de Petri pequena, contendo areia filtrada no fundo, com álcool suficiente para cobrir a areia. Nas larvas de menor tamanho, o material colocado no fundo da placa, foi o algodão umedecido com álcool. Os valores biométricos de cada larva foram devidamente anotados em uma ficha que continha o número do vidro ao qual a larva pertencia (de 1 a 50), o seu número de identificação, o valor (do corpo/pós genae/apódema) e a ocular ao qual foi medida. Para as medições de tamanho, foram utilizados diferentes aumentos de oculares micrométricas, ou seja, para larvas maiores a ocular (mm) foi de aumento 9x e para as larvas menores a ocular (mm) de 20x. As larvas  após a obtenção dos dados, foram acondicionadas individualmente em tubos de vidro, etiquetadas, e imersas em álcool 70%, para posterior montagem em lâmina/lamínula. A verificação das medidas do comprimento do pós-genae (comprimento lateral da cápsula cefálica, indo da base da inserção do leque cefálico até o ápice posterior da cabeça, e a largura do apódema cefálico (Figura 4), foram feitas com base na metodologia utilizada por Gorayeb (1981), Hamada (1989), Alencar (1998) e Cunha et al. (1998).

Figura 4 – Estruturas medidas da cabeça de T. guianense para determinar o número de estádios larvais. A) Comprimento lateral da cápsula cefálica, B) Largura do apódema cefálico.

As medidas do comprimento lateral da cabeça e a largura do apódema cefálico foram anotadas em uma planilha para a realização posterior dos tratamentos estatísticos. Para a comparação dos testes foram utilizados os programas Systat 5.0 e o Bioestat. Os gráficos de freqüência, Dispersão e Log₁₀ foram confeccionados no programa Excell 97.

Para determinação do número de estádios, os dados obtidos dos dois parâmetros examinados (comprimento lateral da cabeça e largura do apódema cefálico), foram colocados em gráficos de distribuição de freqüências, onde o limite entre um estádio e outro foi definido entre os valores mínimos e máximos, ocasionando “picos”, separando um estádio do outro (Gorayeb, 1981; Hamada, 1989).

A precisão do agrupamento dos estádios larvais foi determinada através da regra de crescimento de Crosby, a qual propõe que se as diferenças entre duas razões consecutivas de Brook (razão de Brook = MA+1 / MA, onde MA+1 = média da medida do parâmetro do estádio posterior e MA = média da medida do parâmetro anterior) for maior do que 10% da razão de Brook anterior (diferenças obtidas através da fórmula BA+1 – BA / BA x 100, onde BA+1 = razão de Brook posterior e BA = Razão de Brook anterior) existe possibilidade de ter-se perdido um estádio (Craig, 1975).

As médias do comprimento lateral da cabeça e da largura do apódema cefálico também foram analisadas pelo teste T-Student, no sentido de verificar as diferenças entre as mesmas (significativas ou não) (Ross & Craig, 1979; De Moor, 1982; Hamada, 1989; Alencar, 1998, Cunha et al., 1998).

Para verificação do crescimento geométrico foi utilizado o logaritmo na base 10 das médias do comprimento lateral da cabeça e da largura do apódema cefálico de cada estádio larval. Para a observação de qualquer desvio nos estádios, foi utilizada uma análise de regressão linear, verificando a dispersão dos valores na reta. Segundo a Regra de Dyar, caso ocorra algum desvio significativo, isto indica que algum estádio foi perdido (Dyar, 1890; Wigglesworth, 1961; Ross & Merrit, 1978; Ross & Craig, 1979; De Moor, 1982).

Análise morfométrica dos estádios

As estruturas das larvas foram fotografadas no laboratório da COPEQ, com auxilio de um microscópio AXIOPLAN2/ZEISS, com câmera fotográfica acoplada - modelo DATABACK D4 e utilizado filme colorido KODAK ULTRA400 (35mm) e FUJIFILM AGFA APX25 para fotos em preto e branco. Em cada lâmina analisada as estruturas, foram descritas e fotografadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Determinação Biométrica dos números de estádios

No Brasil, alguns autores contribuíram, nos estudos de larvas, com a descrição de estádios, como: Gorayeb (1981) que detectou 8 estádios larvais para Simulium fulvinotum (= Ectemnaspis rorotaense); Hamada (1989) para Simulium goeldii (= C. goeldii); Alencar (1998) para Simulium perflavum (= Ectemnaspis perflava), com 7 estádios; Alencar, Hamada & Magni-Darwich (2001). Cunha et al. (1998), para Simulium (C.) pertinax (= Chirostilbia pertinax), S. (C.) acarayense (= Chirostilbia subpallida), S.(T.) orbitale (=Thyrsopelma orbitale) com sete estádios e para S.(P.) incrustatum (= Psaroniocompsa incrustata) com oito estádios. Alvan-Aguilar & Hamada (2003), para Simulium rubrithorax (= Hemicnetha rubrithorax) com 7 estádios. Andrade, Strixino, Py-Daniel & Medeiros (2004) para Hemicnetha brachyclada, com 7 estádios. Silva,A.N.B (2006), para Psaroniocompsa incrustata, com 7 estádios. Santos-Neto; Hamada,N. & Couceiro (2015) para Simulium guianense (= Thyrsopelma guianense), com 6 estádios.

No nosso  trabalho os histogramas de distribuição de freqüências das medidas de comprimento lateral da cápsula cefálica e do comprimento da largura do apódema cefálico apresentaram 6 estádios. O número de estádios foi contado a partir do segundo, por que o primeiro estádio não foi considerado no histograma, devido a existência de somente um exemplar, sendo assim, apenas considerado na contagem geral do número de estádios. Portanto, as larvas de T. guianense apresentaram sete estádios (Figuras 5 e 6).

Os valores das médias utilizadas demonstraram uma diferença ( p < 0,001 ) entre um estádio e outro (Tabelas 1 e 2).

No diagrama de dispersão, a correlação existente, onde Y=7,76+0,98, R²=0,96 e n=600, sugere que os valores seguem uma seqüência geométrica de crescimento, e que os valores encontrados são próximos, e que a maioria dos valores ocasionou uma sobreposição dos mesmos em algum estádio (valores de medidas entre o comprimento lateral da cápsula cefálica e o comprimento da largura do apódema cefálico), onde os estádios encontrados seguem uma seqüência linear, altamente correlacionada (Figura 7).

Para verificação de crescimento geométrico, foi utilizada a regra de Dyar (Wiggleshworth, 1961) que relaciona a quantidade de crescimento como também os intervalos entre os estádios. Implica no crescimento geométrico de uma parte do corpo (cápsula cefálica e apódema), aumentando os valores a cada muda, de modo que o crescimento permanece constante para uma determinada espécie. Para verificação da forma e taxa de crescimento durante um estádio larval, os valores das médias de cada parâmetro medido em cada estádio, foram transformados em logaritmo (base 10) e plotados contra o número de estádios que a larva apresentou, para obtenção de uma reta.

O método foi utilizado para as médias de comprimento lateral da cápsula cefálica e do comprimento da largura do apódema das larvas, obtendo as seguintes retas (Log₁₀Y=1,64+0,50, r2 = 0,99 e n=6) para o comprimento lateral da capsula cefálica e (Log₁₀Y=1,43+0,59, r² = 0,97 e n=6) para o comprimento da largura do apódema cefálico, indicando um crescimento geométrico (Figuras 8 e 9). 

Também foi utilizada a regra de crescimento de Crosby, onde valores maiores que 10% (obtidos da divisão do comprimento da cápsula cefálica de um estádio anterior para um posterior) indicam que pode ter ocorrido perda de um estádio (Craig, 1975).

A razão de Brook encontrada para o comprimento lateral da cápsula cefálica mostra que todos os valores foram maior que 10%, e que a para o comprimento da largura do apódema cefálico dois valores maiores foram obtidos, Não é o primeiro caso de valores acima do que é permitido a regra, como demonstra Alencar (2001) citando estudos com Simulium oviceps, onde ocorreu um crescimento anômalo dos artículos antenais. Não foi observado este crescimento anômalo para T. guianense, sugerindo assim exame mais crítico das medidas atuais, para que se possam explicar tais percentuais.

Figura 5 – Histograma de freqüência de larvas de Thyrsopelma guianense (Wise, 1911) em relação às medidas do comprimento lateral da cápsula cefálica.

Figura 6 - Histograma de freqüência de larvas de Thyrsopelma guianense (Wise,1911), em relação às medidas de largura do comprimento do apódema cefálico.

Figura 7 – Reta de Regressão das medidas do comprimento lateral da cápsula cefálica (m) com as medidas do comprimento da largura do apódema cefálico (m) das larvas de Thyrsopelma guianense (Wise, 1911) e as delimitações de cada estádio.

Tabela 1 – Média das medidas do comprimento lateral da capsula cefálica (mm) de larvas de T. guianense. [n = tamanho da amostra; t = Teste t-Student aplicado nas médias de dois estádios consecutivos; * = p < 0,001; % R. de Brook = Porcentagem da diferença entre duas razões de Brook consecutivas].

Tabela 2 – Média das medidas do comprimento da largura do Apódema Cefálico (mm) de larvas de T. guianense. [n = tamanho da amostra; t = Teste t-Student aplicado nas médias de dois estádios consecutivos; * = p < 0,001; % R. de Brook = Porcentagem da diferença entre duas razões de Brook consecutivas].

Os números obtidos nas medições do comprimento lateral da cápsula cefálica e do comprimento da largura do apódema cefálico, mostraram que para T. guianense, os valores do apódema foram similares às medidas de comprimento lateral da capsula cefálica e que em algum estádio de crescimento largura do apódema e comprimento lateral da capsula cefálica tiveram a mesma medida, como nos estádios II (valores 70 e 90 mm), V (valores 260 e 300 mm) e estádio VI (valor 350 mm), respectivamente Tabelas 3 e 4).

A determinação de sete estádios pelos quais passam as larvas de T. guianense mostram um padrão similar ao encontrado por Cunha et al. (1998) em outra espécie do gênero Thyrsopelma (T. orbitale).

Figura 8 – Regressão Linear do Log₁₀ das médias do comprimento lateral da cápsula cefálica, contra os respectivos estádios larvais.

Figura 9 – Regressão Linear do Log₁₀ da médias do comprimento de largura do Apódema Cefálico, contra os respectivos estádios larvais.

Tabela 3 – Valores brutos transformados (mm - mm) e freqüência do comprimento lateral da capsula cefálica de T. guianense.

Tabela 4 – Valores brutos transformados (mm - mm) e freqüência do comprimento da largura do Apódema Cefálico de T. guianense.

Descrições dos estádios larvais

Larva de primeiro estádio – Cabeça mais larga que o tórax. Leque cefálico com 12 raios e sem microtríquias aparentes. Antena uni-segmentada, mais longa que o comprimento da base do leque cefálico, com sensila cônica n na extremidade e sem estriações. Haste do leque cefálico aparentemente pouco esclerotizada. Dois pares de estemas visíveis, sendo o estema distal menor que o proximal, em relação ao corpo, ambos os estemas com formato mais ou menos circular. Abdome delgado, entumecido na extremidade posterior e sem escamas. Disco anal com três ganchos por fileira (Figuras 10 a 13).

Figura 10 – Primeiro estádio larval - larva eclodida, extremidade posterior (100x)

Figura 11 - Primeiro estádio larval – Leques Cefálicos (40x)

Figura 12 - - Primeiro estádio larval – Ganchos das fileiras do Disco Anal  (100x)

Figura 13 - - Primeiro estádio larval –  Disco Anal (100x)

Larva de segundo estádio – Cabeça: Setas frontais situadas na região supra-mandibular. Inseridas logo acima da base do dente apical, não ultrapassando o ápice do dente apical, presença de escova adoral. Antena com dois segmentos bem definidos, uma sensila cônica na extremidade distal, o primeiro segmento antenal menor do que a haste do leque cefálico. Leque cefálico com 16 raios, e microtríquias, curtas, esparsas e desalinhadas. Mandíbula contendo 1 dente apical fortemente esclerotizado e 5 dentes internos, sendo 3 dilatados e 2 delgados, dente basilar bífido ausente. Hipostômio com 6 dentes. Abdome: Ápice do pseudópodo torácico com 3 a 4 ganchos por fileira. Disco anal apresentando 5 ganchos por fileira (Figuras 14 a 17).

Figura 14 – Segundo estádio larval – Pseudópodo torácico (100x)

Figura 15 – Segundo estádio larval – Ganchos do Disco Anal (100x)

Figura 16 - Segundo estádio larval – Antena (100x)

Figura 17 - Segundo estádio larval – Raios do Leque Cefálico (100x)

Larva de terceiro estádio – Cabeça: Leque cefálico com 22 raios filiformes, sem manchas e não diferenciados; Mandíbula com escova adoral contendo setas anteriores curtas e setas posteriores longas; 1 dente apical e 6 dentes internos. Sendo 3 dilatados e com ápices voltados para a área posterior da mandíbula e 3 delgados e não curvados; dente basilar não bífido, e dente externo supra mandibular; Hipostômio com 9 dentes, sendo que os 4 laterais são do mesmo tamanho e o dente central mais proeminente que os demais, dentes de formato cônico e muito esclerotizados na porção apical. Antena com 2 segmentos, e ultrapassando a haste do leque cefálico (HLC). Abdome: Ápice do pseudópodo torácico com 4-5 ganchos por fileira. Disco anal com 8  ganchos por fileira (Figuras 18 a 23).

Figura 18 - Terceiro estádio larval – Antena e haste do Leque Cefálico (HLC) (100x)

Figura 19 - Terceiro estádio larval – Leque Cefálico (40x)

Figura 20 - Terceiro estádio larval – Mandíbula, dentes e Escova Adoral (100x)

Figura 21 - Terceiro estádio larval – Hipostômio (100x)

Figura 22 - Terceiro estádio larval – Pseudópodo torácico (40x)

Figura 23 - Terceiro estádio larval – Ganchos do Disco Anal (100x)

Larva de quarto estádio – Cabeça: Leques cefálicos sem manchas e com microtríquias de tamanho médio, distante uma das outras. Mandíbula com 8 dentes internos, sendo 3 dentes robustos, 5 medianos (3 maiores e 2 menores), ponta do dente basilar bífida e em processo de crescimento, ponta próxima aos dentes medianos maior em relação à outra, setas frontais presentes, 1 dente externo acima do dente apical. Escova adoral com muitas setas filiformes, setas anteriores curtas e setas posteriores longas. Antena com 3 segmentos. Hipostômio com 9 dentes, sendo 1 dente central, 2 dentes pontas isométricos, 3+3 dentes intermediários (entre os dentes pontas e o central) com mesmo tamanho e forma; dente interno central do hipostômio mais esclerotizado que os demais; com 1 fileira de setas hipostomiais, número de setas por fileira igual a 3. Abdome: escamas petaliformes restritas e escassas, esparsas e restritas à área dos tergitos posteriores; 8 ganchos por fileiras no pseudópodo torácico. Com 11-12 ganchos por fileira no disco anal; esclerito anal em forma de X, com braços anteriores menores que os braços posteriores, unidos na porção basilar (estádio não fotografado).

Larva de quinto estádio - Cabeça: Antena com 3 segmentos, o último artículo com sensila cônica. Esclerito labral com 2+2 dentes anteriores. Escova adoral com setas anteriores mais curtas que as posteriores; dentes pontas hipostomiais com uma projeção lateral, apresentando uma certa bifurcação; Hipostômio com 9 dentes, sendo 1+1 pontas, 1 dente central do mesmo tamanho e forma que os 6 intermediários, sendo que os dentes pontas e central são mais expandidos e robustos que os dentes intermediários, que são delgados; 3 setas hipostomiais por fileira, na região lateral. Fenda Gular profunda e maior do que a Ponte Pré-Gular. Microtríquias do Leque Cefálico mais numerosas que nos dois primeiros estádios, filiformes, simples e sem repartições, Leques Cefálicos sem manchas; Mandíbula com 6 dentes internos, sendo 3 pré-apicais (2 mais expandidos, curvo e 1 menos expandido e não curvo, 2 dentes externos, dente basilar da mandíbula não bífido, de ápice retilíneo. Presença de 2-4 setas frontais supra mandibulares. Abdome: Disco anal com 11 ganchos por fileira; ausência parcial de escamas petaliformes no corpo, quando presentes, inseridas nos tergitos, restritas à área perto do esclerito anal. Ápice do pseudópodo torácico com 7-8 ganchos por fileira (Figuras 24 a 27).

Figura 24 – Quinto estádio larval – Antena (40x)

Figura 25 - Quinto estádio larval – Fileiras de ganchos do Disco Anal (100x)

Figura 26 - Quinto estádio larval – Ápice mandibular, Dente Apical e Dentes Internos (100x)

Figura 27 - Quinto estádio larval – Raios do Leque Cefálico, e microtríquias filiformes (100x)

Larva de sexto estádio – Cabeça: Leque cefálico com 34 raios e microtríquias abundantes; antena com 3 segmentos; esclerito labral com 2+2 dentes anteriores; mandíbulas com 1 dente apical fortemente esclerotizado, com 8 dentes internos, sendo os 3 internos anteriores mais robustos que os outros; dente basilar bífido; hipostômio com 9 dentes muito esclerotizados, dente central e os dos pontas do mesmo tamanho, borda dos dentes simples, dente próximo ao dente ponta com curvatura voltada para a região central do hipostômio, os dois dentes pontas maiores, retilíneos e mais pontiagudos que os demais, 4 setas hipostomiais por fileira, de tamanho decrescente em relação a base do hipostômio. Abdome: Disco anal apresentando 19 ganchos por fileira, esclerito anal em forma de “X”, com braços esclerotizados. Escamas petaliformes esparsas, inseridas nos tergitos, restritas à porção posterior da larva e localizadas mais próximas ao esclerito anal (Figuras 28 a 33).

Figura 28 – Sexto estádio larval – Vista dorsal da Cápsula Cefálica, com Antenas, Leques Cefálicos, Esclerito Labral (20x)

Figura 29 - Sexto estádio larval – Porção apical da Cápsula Cefálica, mostrando os raios do Leque Cefálico e Esclerito Labral (20x)

Figura 30 - Sexto estádio larval – Ápice da Mandíbula, apresentando os dentes internos, apical e externos (100x).

Figura 31 - Sexto estádio larval – Hipostômio (40x)

Figura 32 - Sexto estádio larval – Fileiras de ganchos do Disco Anal (100x)

Figura 33 - Sexto estádio larval – Esclerito Anal e Disco Anal (20x)

Larva de sétimo estádio – Cabeça: Leque cefálico com 36 raios, microtríquias em maior número que no estádio anterior, presentes em toda a extensão do raio, exceto na região basilar, filiformes. Raios do leque cefálico filiformes, sem diferenciação. Esclerito labral com 2+2 dentes. Fenda Gular profunda. Hipostômio com 9 dentes esclerotizados, sendo os dentes internos intermediários menores que os internos externos, dente intermediário externo com inserção no dente ponta, presença de 4+4 setas hipostomiais filiformes, sendo 3 maiores. Mandíbula com 1 dente apical muito exclerotizado, 9 dentes internos, sendo os 3 distais robustos e curvos, e os 2 médios e 4 posteriores delgados. Dente basilar bífido, sendo o mais anterior maior; presença de dois dentes externos, presença de 3 setas frontais.Corpo: Tergitos bastante diferenciados, com presença de escamas petaliformes distribuídas ao longo dos mesmos. Ápice do pseudópodo com ganchos por fileira variando em entre 12-13. Disco Anal com 19 ganchos por fileira, esclerito anal em forma de “X”, sendo os braços anteriores mais curtos que os posteriores (Figuras 34 a 42).

Figura 34 - Sétimo estádio larval – Hipostômio (40x)

Figura 35 - Sétimo estádio larval – Histoblasto branquial, Pseudópodo torácico (20x)

Figura 36 - Sétimo estádio larval – Histoblasto branquial aberto (10x)

Figura 37 - Sétimo estádio larval – Fileiras de ganchos do Pseudópodo torácico (100x)

Figura 38 - Sétimo estádio larval – Escamas petaliformes inseridas nos tergitos (100x)

Figura 39 - Sétimo estádio larval – Ápice mandibular (100x)

Figura 40 - Sétimo estádio larval – Raios do Leque Cefálico e microtríquias (100x)

Figura 41 - Sétimo estádio larval – Esclerito Anal (em forma de “X” e Disco Anal) (20x)

Figura 42 - Sétimo estádio larval – Fileiras de ganchos do Disco Anal (100x)

CONCLUSÕES

As larvas de Thyrsopelma guianense (Wise, 1911) apresentaram sete estádios.

Devido à Razão de Brook ser maior que 10% e observando que este não é o primeiro trabalho que isto ocorreu, é sugerido que a metodologia, para determinação de crescimento de estruturas esclerotizadas, seja revista.

Foi observado que as estruturas que mais se diferenciaram foram: Leques cefálicos (raios e microtríquias), mandíbula, hipostômio, número de artículos antenais, número de ganchos do pseudópodo torácico, número de ganchos do disco anal, presença/ausência das brânquias torácicas (histoblastos branquiais), aparecimento da distinção dos tergitos, forma do esclerito labral, forma do esclerito anal.

A população Thyrsopelma guianense do rio Jacaré, no Estado do Piauí, estudada por Santos-Neto et al. (2015) apresentou o estágio larval com 6 estádios, diferente do número encontrado por nós para a população do rio Jauaperí, no Estado de Roraima, assim, para o gênero Thyrsopelma atualmente existem dois números de estádios descritos: (T. orbitale = 7 estádios; T.guianense =  6-7 estádios).

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